活體顱骨光透明技術在光學成像中的應用

時間：2024-05-21 熱度：412

活體腦成像對于研究大腦生理病理活動有著至關重要的意義?，F(xiàn)代光學成像技術侵入性低、分辨率高，因而能夠用于活體觀測生物結構和功能，在腦科學領域發(fā)揮著重要作用。但是，在活體狀態(tài)下，大腦有顱骨覆蓋，而顱骨對光的強散射和像差嚴重限制了光的穿透深度，進而影響了皮層成像的分辨率和深度。為了克服顱骨的散射，以往的研究往往需要在成像前建立各類手術顱窗，主要包括開顱玻璃窗、磨薄顱骨窗以及它們的變體。

磨薄顱骨窗的建立通過將部分顱骨磨薄至約 25 μm左右，從而實現(xiàn)對皮層的活體高分辨觀測。但磨薄顱骨窗不適用于大視場觀測皮層，因為將大面積的顱骨均勻地磨薄至25 μm的難度非常大。另外，顱骨被磨薄后會重新生長，并且新生的顱骨易碎，難以實現(xiàn)多次的重復打磨。所以，磨薄顱骨窗不適用于長期跟蹤觀測。開顱手術容易導致炎癥反應及氧化應激反應，進而開顱后3天逐漸形成白色絮狀物影響后續(xù)成像效果，且往往會持續(xù)約 2周，因此并不適合急性模型（3天以內）的觀測及長期（2周以上）活體成像監(jiān)測。

近些年興起的組織光透明技術可以降低生物組織的散射，增強光在組織中的穿透能力，已被廣泛應用于離體大組織甚至全器官三維高分辨成像。不僅如此，組織光透明技術在活體水平也得到了很好的應用。研究人員發(fā)展的活體顱骨光透明技術，以及基于此建立的光透明顱窗，可以在不進行開顱手術的情況下，結合多種現(xiàn)代光學成像手段，實現(xiàn)大腦皮層的神經血管結構和功能的無創(chuàng)成像觀測。針對不同的應用場景，開發(fā)了不同的光透明顱窗，可以分別滿足高分辨、大視場、長時程觀測等要求。相比于開顱玻璃窗，光透明顱窗可以避免手術帶來的炎癥反應等副作用，從而適用于急性觀測；而相比于磨薄顱骨窗，光透明顱窗可以通過反復操作而觀測數(shù)月，從而實現(xiàn)長期跟蹤監(jiān)測。

?目前的活體顱骨光透明方法包括以下幾種：（1）SOCS:實現(xiàn)活體顱骨光透明[1]；（2）SOCW:實現(xiàn)穿顱神經樹突棘成像[2]?；（3）USOCA:可開合的大視場顱窗[3]；（4）VNSOCA:可見-近紅外兼容的光透明顱窗[4]；（5）用于長期觀測的光透明顱骨窗（TIS）[5]。本文主要介紹活體顱骨光透明技術在光學成像中的應用。

（1）激光散斑襯比/高光譜成像

激光散斑血流成像系統(tǒng)采用激光散斑技術，可以對組織血流進行連續(xù)監(jiān)測，具有非接觸、無創(chuàng)傷、快速成像等優(yōu)點，可用于記錄由于皮膚營養(yǎng)和體溫調節(jié)等因素引起的毛細血管、微靜脈和微動脈中的血流變化；高光譜成像技術是一種非標記的血氧分布成像技術。顱骨光透明技術的出現(xiàn)使其得以在完整顱骨下獲取皮層血流及血氧信息。

圖1. 重復光透明成像用于皮層血流和血氧監(jiān)測[3]。（a）顱骨短期重復透明成像；（b）顱骨長期重復透明成像。

利用顱骨光透明技術，可以持續(xù)一周地每天對小鼠進行顱骨透明化操作并獲取血流血氧信息（圖1. a）。不僅如此，研究人員對 2 月齡的小鼠進行了每月一次、為期 5個月的持續(xù)成像，并成功觀察到皮層血管網的動態(tài)變化，即部分血管的消失和新生（圖1. b）。除了對單側顱骨進行透明外，研究人員還對小鼠雙側顱骨進行光透明處理，用于監(jiān)測大腦中動脈阻塞（MCAO）后雙側皮層血流及血氧變化（圖2）。

圖2. 光透明顱窗用于監(jiān)測MCAO引起的皮層血流動力學變化[3]。（a）MCAO前后雙側皮層血流及血氧變化；（b-c）皮層血流及血氧變化柱狀圖。

（2）光聲成像

光聲成像技術是近年來興起的一種新型無損醫(yī)學成像方法，兼具光學的高對比度和超聲的高穿透性。

光聲成像原理：當一束光照射到生物組織上，生物組織吸收光能量而產生熱膨脹，伴隨著熱膨脹會產生超聲波，吸收光能量的多少決定了產生的超聲波的強度。不同的組織會產生不同強度的超聲波，可以用來區(qū)分正常組織和病變組織。

光聲成像技術檢測的是超聲信號（該技術克服了光學成像技術在成像深度與分辨率上不可兼得的不足），反映的是光能量吸收的差異（補充超聲成像技術在對比度和功能性方面的缺陷），結合光學和超聲這兩種成像技術各自的優(yōu)點，能實現(xiàn)對組織體較大深度的高分辨率、高對比度的功能成像。

研究人員將活體皮膚光透明試劑注射到小鼠皮下后，對皮下血管進行光聲成像。結果表明：在所有檢測頻率下，光聲信號都顯著升高，極大地改善了小血管和大血管的可視化，定量分析結果顯示皮下血管造影深度增加了3~4倍（圖3a）。此外，研究人員還將活體皮膚光透明試劑與超聲凝膠混合后涂抹在小鼠皮膚表面，作為耦合劑使用。結果發(fā)現(xiàn)在試劑作用后，皮膚略微透明，大、小血管的可視化都得到了改善，并且光聲成像深度顯著增加，血管造影深度提高1.5~2倍（圖3b）。

圖3. 活體皮膚光透明用于光聲成像獲取小鼠皮下血管結構[4]。（a）小鼠皮下注射活體皮膚光透明試劑后，血管光聲成像改善效果。（b）小鼠皮膚涂抹活體皮膚光透明試劑后，血管光聲成像改善效果。

（3）受激拉曼成像

受激拉曼散射成像是一種無需熒光標記的新型生物化學成像技術。依據(jù)物質中分子化學鍵振動頻率的特異性，可以檢測生物樣本中的多類物質。展現(xiàn)出了無標記、快速、高靈敏度、高特異性等優(yōu)勢。研究人員通過受激拉曼成像分析了顱骨光透明過程中顱骨的主要成分---膠原蛋白和羥基磷灰石（鈣質）的變化，對顱骨光透明技術的作用機制進行了分析。研究發(fā)現(xiàn)活體顱骨光透明的基本原理是（部分）去除顱骨中的鈣質、脂質和蛋白質，并使用折射率匹配試劑進一步提高透明效果（圖3）。該研究為未來活體光透明方法的發(fā)展提供了理論依據(jù)，可以用于篩選更高效的活體顱骨及其他組織光透明方法。

圖3. 受激拉曼成像揭示顱骨光透明技術的機制[7]。（a-c）幼年小鼠頂骨中膠原纖維和羥基磷灰石顯微結構圖像。顱骨未處理（a），10 %膠原酶處理（b），10 % EDTA處理（c）。（d-f）成年小鼠頂骨中膠原纖維和羥基磷灰石的微觀結構變化。顱骨未處理（d）， USOCA處理（e），10 % EDTA處理（f）。

（4）雙光子/三光子成像

與其它光學活體成像相比，雙光子/三光子成像具有較高的空間分辨率，可實現(xiàn)細胞與亞細胞分辨水平的結構成像研究，以其大穿深、低光毒性、低光漂白等優(yōu)點而被廣泛應用于活體和活細胞/組織的成像觀察。一般來說，雙光子/三光子應用于神經科學研究時需要配合開顱玻璃窗或者磨薄顱骨窗，而活體顱骨光透明技術的發(fā)展為其應用提供了一種新型的非侵入式的觀測思路。

如圖4所示，活體皮膚光透明技術能夠顯著提升皮下免疫細胞雙光子成像的效果。一方面，雙光子成像獲取的圖像信號強度和信噪比都顯著提高；另一方面，活體雙光子成像的深度也得到極大提升（2~3倍）。

圖4. 活體皮膚光透明用于雙光子成像觀測小鼠足部免疫細胞^[1]。

借助活體皮膚光透明技術，研究人員還研究了糖尿病對小鼠皮膚免疫功能的影響。在糖尿病小鼠足墊誘發(fā)延遲型超敏反應（DTH）后，通過雙光子成像觀察單核/巨噬細胞在不同時間點的響應。結果發(fā)現(xiàn)糖尿病小鼠DTH后單核/巨噬細胞的浸潤和募集增加，但其運動能力明顯減弱，說明單核/巨噬細胞免疫功能異常，并且其功能異常隨著糖尿病的進展而進一步增強（圖5）。通過體內皮膚光透明提高光學成像深度，可以比較炎癥部位周圍不同深度的單核/巨噬細胞的運動行為。對于正常小鼠來說，在DTH早期（DTH-4 h）皮膚深層單核/巨噬細胞的遷移距離明顯大于淺層，而在DTH晚期（DTH-72 h）則相反，說明不同深度的皮膚免疫反應存在差異。

圖5. 活體皮膚光透明用于雙光子成像獲取糖尿病小鼠不同階段（T1D-1 w、T1D-2 w、T1D-4 w）在DTH后不同時間點（DTH-4 h、DTH-24 h、DTH-48 h、DTH-72 h足部單核/巨噬細胞募集情況^[6]。

與雙光子成像技術相比，三光子成像技術擁有更高的空間分辨率。此外，由于三光子熒光與三次諧波發(fā)光所用的激發(fā)波長相較于雙光子更長，因此具有更大的成像深度。這些特征使三光子成像在深層組織和高分辨生物成像領域具有重要的應用前景。而活體顱骨光透明技術同樣可以用于三光子成像。經過顱骨光透明作用后，三光子成像獲取的皮層血管三次諧波信號得到顯著增加，而且皮層神經元成像的深度和對比度都得到顯著提升（圖6），這為腦皮層深層信號的獲取提供了有力的手段。

圖6. 光透明顱窗用于三光子成像[4, 5]。（a-c）顱骨光透明作用前后皮層血管白光圖（a）、三次諧波信號（b）、神經元信號三維重構（c）。

（5）光操控

現(xiàn)代光學技術不僅可以獲得高分辨率的神經血管圖像，而且可以對大腦皮層進行操控或建立特定的模型?；陲B骨光透明技術的窗口，也可替代開顱窗和磨薄窗，用于皮層光操控。比如，結合光透明顱窗和光動力效應，既可以打開血腦屏障，也可以建立靶向缺血性腦卒中模型；此外，透過光透明顱窗，將飛秒激光聚焦在血管上，可以實現(xiàn)對單根血管的燒蝕，從而建立局部靶向的出血性腦卒中模型。

研究人員利用光透明顱窗，在不開顱的情況下實現(xiàn)了光動力效應打開血腦屏障，并可以在活體水平跟蹤熒光染料的滲漏過程（圖7. a），隨后進一步研究了光動力效對于不同年齡小鼠血腦屏障功能影響的差異性。這些研究為腦藥物遞送和腦疾病的治療提供了一種新的手段。此外，研究人員還將活體顱骨光透明技術與光栓技術相結合，在非開顱的情況下，實現(xiàn)了對大腦皮層血管的靶向栓塞。通過改變激光照射位置和照射劑量，可以對栓塞程度和栓塞區(qū)域進行調節(jié)（圖7. b），該模型可以用于評估溶栓藥物對不同尺寸血管的溶栓治療效果。

圖7. 顱骨光透明技術用于皮層光操控[8, 9]。（a）光透明顱窗結合光動力效應打開血腦屏障；（b）光透明顱窗結合光動力效應實現(xiàn)光栓模型建立。

展望

活體顱骨光透明技術已經應用于多個領域，如神經血管成像、皮層光操控、建立特定的疾病模型等，為活體皮層觀測提供了一個無需開顱的光學窗口。不同的腦科學研究對顱窗提出了不同的要求。比如，神經突觸成像需要高分辨觀測，許多疾病的研究需要長時程跟蹤，急性病理模型需要建窗口立即觀測，神經功能成像需要在清醒動物上開展，跨腦區(qū)研究需要較大的觀測視場。而光透明顱窗發(fā)展至今，已同時具備了高分辨、大視場、長時程、適用于急性觀測的優(yōu)勢，因而有望在某些傳統(tǒng)顱窗無法勝任的場合（比如急性創(chuàng)傷性腦損傷的跨腦區(qū)觀測）提供重要的技術支撐，從而在未來的腦科學研究中大放異彩。但是，仍舊要意識到目前顱骨光透明技術依然有所限制。比如，目前尚未有適用于更大動物（比如大鼠、獼猴等）的活體顱骨光透明方法，這需要研究人員繼續(xù)探索更高效的顱骨光透明方法。未來更好的顱骨光透明的出現(xiàn)，結合更多的成像方法，會為腦科學的發(fā)展提供更有力的技術保障。

參考文獻：

[1]WANG Jing，ZHANG Yang，XU Tonghui，et al. An innovative transparent cranial window based on skull optical clearing. Laser Physics Letters, 2012, 9(6): 469-473.

[2]ZHAO Yanjie，YU Tingting，ZHANG Chao，et al. Skull optical clearing window for in vivo imaging of the mouse cortex at synaptic resolution. Light-Science & Applications，2018，7（2）：17153.

[3]ZHANG Chao，F(xiàn)ENG Wwei，ZHAO Yanjie，et al. A large, switchable optical clearing skull window for cerebrovascular imaging. Theranostics，2018，8（10）：2696-2708.

[4]LI Dongyu，ZHENG Zheng，YU Tingting，et al. Visible-near infrared- Ⅱ skull optical clearing window for in vivo cortical vasculature imaging and targeted manipulation. Journal of Biophotonics，2020，13（10）：e202000142.

[5]Li D, Hu Z, Zhang H, et al. A Through-Intact-Skull (TIS) chronic window technique for cortical structure and function observation in mice [J]. eLight, 2022, 2(1): 15.

[6]Yang X, Zhang Y, Zhao K, et al. Skull optical clearing solution for enhancing ultrasonic and photoacoustic imaging [J]. IEEE Trans Med Imaging, 2016, 35(8): 1903-6.

[7]CHEN Yage，LIU Shaojun，LIU Hongjie，et al. Coherent Raman scattering unravelling mechanisms underlying skull optical clearing for through-skull brain imaging. Analytical Chemistry，2019，91（15）：9371-9375.

[8]Zhang C, Feng W, Vodovozova E, et al. Photodynamic opening of the blood-brain barrier to high weight molecules and liposomes through an optical clearing skull window [J]. Biomedical optics express, 2018, 9(10): 4850-62.

[9]Li D, Deng L, Hu Z, et al. Optical clearing imaging assisted evaluation of urokinase thrombolytic therapy on cerebral vessels with different sizes [J]. Biomed Opt Express, 2022, 13(6): 3243-58.

[10]Xu C. Optical clearing of the mouse skull [J]. Light, science & applications, 2022, 11(1): 284.

[11]李東宇,俞婷婷,朱京譚,朱?.活體顱骨光透明方法及應用（特邀）[J].光子學報,2022,51(08):252-268.

重慶宣尊生物科技有限公司成立于2019年10月11日。公司主要經營基礎醫(yī)學科研服務（病毒包裝，影像檢測micro-CT,MRI3.0T/7.0T/9.4T,透射電鏡，3D透明化成像，小動物活體成像，光聲成像，散斑血流成像，檢測分析服務、藥物靶標篩選服務、細胞模型構建、動物模型構建以及分子生物學相關技術服務），代理銷售科研試劑、耗材、轉基因鼠及設備，公司是一家專注于技術服務和檢測技術的高科技企業(yè)，為基礎科研和基因治療臨床前研究提供完善的解決方案，是重慶市高新區(qū)重點支持與打造的高新技術型企業(yè)。

2022年，公司開始搭建基礎科研服務平臺，建立技術服務核心團隊。公司擁有16項軟件著作權，逐步向平臺化發(fā)展。2023年，公司成為市級高新技術企業(yè)，發(fā)展方向由銷售型公司轉型向平臺化發(fā)展。線上搭建互聯(lián)網平臺，提供高效、便利、低成本的服務，加速科研圈互聯(lián)網化；線下籌建多地辦公室，推進科研技術服務落地，提高研發(fā)效率。公司致力于打造一站式基礎科研服務平臺，秉承“尊重、共享、高效、協(xié)作”的經營理念，堅持“宣揚品質，尊重科研” 的使命，為基礎醫(yī)學科研領域提供優(yōu)質的“互聯(lián)網+”式綜合科研技術服務。

如您對活體顱骨光透明技術在光學成像中的應用感興趣，歡迎撥打官方電話或掃描文章底部的微信二維碼進行交流與合作~